Pestizidanalyse von Lanolin

5.1.1. Gelchromatographie-Bedingungen:

Gelsäule: Bio Beads SX-3, Inhalt: 50 g (entspricht 32 cm Säulenlänge)
Elutionsmittel: Ethylacetat/Cyclohexan (1/1 V/V)
Elutionsgeschwindigkeit: 5 ml/min, Injektionsvolumen: 5 ml
Dump Zeit: 20 min, Collect Zeit: 15 min , Wash Zeit: 1 min

5.2. Gaschromatograph

Fisons Instruments HRGC Mega 2 Series mit ECD und NP-FID und automatischem Flüssig-Probengeber, Modell AS-200S

5.2.1. Trennsäulen für die Gaschromatographie

Säule 1 : Fused Silica Kapillarsäule DB-1, 25 m x 0,32 mm ID. Filmdicke 0,25 µm, Fa. Fisons Instruments
Säule 2 : Fused Silica Kapillarsäule OV-1701-DF 25 m x 0,32 mm ID, Fa. Macherey-Nagel, Düren

Trägergas : Wasserstoff Säulenvordruck 75 Kpa
Spülgas : Argon/Methan (95/5 V/V) 40 ml/min
Detektor : ECD - Ni-63
Einspritzvolumen : 2 µl
Split : 1:10

Temperaturprogramm :
Injektortemperatur : 250°C
Detektortemperatur : 300°C
Säulentemperatur :

5.2.3. Meßbedingungen für Organophosphorpestizide

Trägergas : Wasserstoff, Säulenvordruck 50 Kpa
Brenngase : Luft, 100 Kpa, Wasserstoff, 50 Kpa
Hilfsgas : Helium, 50 Kpa
Detektor : NP-FID
Einspritzvolumen : 3-5 µl
Split : 1:10

Temperaturprogramm:

Injektortemperatur : 250°C
Detektortemperatur : 300°C
Säulentemperatur : 80°C (1 min)
80°C bis 250°C (10°C/min) 15 min

Organochlorpestizide	Organophosphorpestizide
Hexachlorbenzol alpha-HCH beta-HCH Lindan delta-HCH Aldrin Dieldrin Endrin Heptachlor cis-Heptachlorepoxid trans-Heptachlorepoxid cis-Chlordan trans-Chlordan Methoxychlor alpha-Endosulfan beta-Endosulfan Endosulfansulfat 2,4'-DDD 4,4'-DDD 2,4'-DDE 4,4'-DDE 2,4'-DDT 4,4'-DDT Tetradifon Pyrethroide Cypermethrin cis-Permethrin trans-Permethrin Fenvalerat Deltamethrin Cyfluthrin Cyhalothrin	Bromophos-ethyl Bromophos-methyl cis-Chlorfenvinphos trans-Chlorfenvinphos Carbophenothion Chlorpyrifos-ethyl Chlorpyrifos-methyl Diazinon Dichlofenthion Fonophos Dimethoat Parathion-ethyl Parathion-methyl Malathion Propetamphos Fenchlorphos Fenitrothion Tetrachlorvinphos Primiphos-methyl Primiphos-ethyl

7.1. Probenvorbereitung und Reinigung
Die Wollwachsproben werden nach folgender Arbeitsvorschrift aufgearbeitet:
- Das Wollwachsmuster wird bei 50-70°C in einem Wasserbad eingeschmolzen und mit einem Glasstab homogenisiert. Vom Homogenisat wird je 1 g Probenmaterial in einem Reagenzglas eingewogen, mit internen Standards von je 500 ng (z.B. Ethion, Mirex) versetzt.

- Die Wollwachsprobe wird nochmals in einem Wasserbad eingeschmolzen und in 10 ml Cyclohexan/Ethylacetat (1/1 V/V) aufgenommen.
Anschließend wird die Probe 1 min lang im Ultraschallbad homogenisiert und über einen Teflon-Membranfilter filtriert.

- Der gereinigte Extrakt wird im Rotationsverdampfer bei leichtem Unterdruck von 0,6 bar und 40-50°C Wasserbadtemperatur vorsichtig bis ca. 5 ml eingeengt und nach Zugabe von 5 ml Iso- octan erneut bis 1-2 ml einengt; anschließend überführt man mit einer Pasteurpipette auf die vorbearbeitete Kieselgelsäule. Dabei spült man den zum Einengen verwendeten Kolben mit 2 ml Elutionsmittel 1 und gibt dieses auf die Säule.
Von diesem Zeitpunkt an wird das Eluat in einem Spitzkolben (Inhalt 25 ml) als Vorlage aufgefangen.
Man eluiert mit weiteren 6 ml Elutionsmittel 1. Diese Lösung bildet das Eluat 1. Die Chromatographie wird auf die gleiche Weise fortgesetzt und zwar nacheinander mit den Elutionsmitteln 2, 3, 4, 5. Dabei spült man jeweils den Kolben mit 2 ml des entsprechenden Elutionsmittel aus und eluiert mit weiteren 6 ml. Man erhält die Eluate 2, 3, 4, 5.

- Den Kieselgel-Säuleneluaten 1 bis 5 werden getrennt jeweils 0,5 ml Decan als Keeper vor dem Einengen zugesetzt, unter den gleichen Bedingungen vorsichtig bis ca. 1 ml eingeengt, auf ein definiertes Volumen (2 ml) mit Cylohexan eingestellt und 1 min lang im Ultraschallbad behandelt.

- In der Regel werden die Eluate 1 und 2 für die Bestimmung von Organochlor- und Organophosphorpestiziden und Pyrethroiden eingesetzt. Die Eluate 3, 4 und 5 werden für die Bestimmung von Organophosphorpestiziden und Pyrethroiden eingesetzt. Die Verteilung der Pestizide auf die einzelnen Kieselgel- fraktionen ist der Tab. 1 zu entnehmen.


Tabelle 1. Elutionsbedingungen bei Kieselgel-Säulen-
           Chromatographie


Parameter                   Kieselgel-Eluate
                             E1 E2 E3 E4 E5
-----------------------------------------------

Organochlorpestizide
alpha-HCH                    5  0  0  0  0
beta-HCH                     5  0  0  0  0
Lindan                       5  0  0  0  0
Hexachlorbenzol              5  0  0  0  0
delta-HCH                    5  0  0  0  0
Aldrin                       5  0  0  0  0
Dieldrin                     0  5  0  0  0
Endrin                       0  5  0  0  0
Heptachlor                   5  0  0  0  0
cis-Heptachlorepoxid         3  3  0  0  0
trans-Heptachlorepoxid       3  3  0  0  0
cis-Chlordan                 5  0  0  0  0
trans-Chlordan               5  0  0  0  0
alpha-Endosulfan             2  4  0  0  0
beta-Endosulfan              0  5  0  0  0
Endosulfansulfat             0  5  0  0  0
Methoxychlor                 0  5  0  0  0
Mirex                        0  5  0  0  0
2,4'-DDD                     5  0  0  0  0
4,4'-DDD                     5  0  0  0  0
2,4'-DDT                     5  0  0  0  0
4,4'-DDT                     5  0  0  0  0
4,4'-DDE                     5  0  0  0  0
Tetradifon                   0  5  0  0  0


Pyrethroide
Deltamethrin                 0  5  0  0  0
cis-Permethrin               0  5  1  0  0
trans-Permethrin             0  5  1  0  0
Cypermethrin                 0  5  0  0  0
Fenvalerat                   0  5  0  0  0
Cyahalothrin                 0  5  0  0  0
Cyfluthrin                   0  5  0  0  0



Organophosphorpestizide

Diazinon                     0  0  5  0  0
Dimethoat                    0  0  0  3  3
Malathion                    0  5  0  0  0
Dichlofenthion               3  3  0  0  0
cis-Chlorfenvinphos          0  5  0  0  0
trans-Chlorfenvinphos        0  5  0  0  0
Bromophos-ethyl              5  1  0  0  0
Bromophos-methyl             4  2  0  0  0
Tetrachlorvinphos            0  0  4  1  0
Fonofos                      0  4  1  0  0
Fenitrothion                 0  4  0  0  0
Fenchlorphos                 4  2  0  0  0
Ethion                       0  5  0  0  0
Parathion-ethyl              0  4  1  0  0
Parathion-methyl             0  4  1  0  0
Chlorpyriphos-ethyl          2  4  0  0  0
Chlorpyriphos-methyl         1  4  0  0  0
Carbophenothion              0  4  0  0  0
Propetamphos                 0  5  0  0  0
Pirimiphos-ethyl             0  5  0  0  0
Pirimiphos-methyl            0  5  0  0  0

-------------------------------------------------------

Elutionsmittel 1: n-Hexan-Toluol/Gemisch, 65/35 V/V
Elutionsmittel 2: Toluol
Elutionsmittel 3: Toluol/Aceton/Gemisch, 95/5  V/V
Elutionsmittel 4: Toluol/Aceton/Gemisch, 80/20 V/V
Elutionsmittel 5: Aceton

0 = keine Wiederfindung; 1 = unter 10%; 2 = etwa 10-30%;
3 = etwa 30-60%; 4 = etwa 60-90%; 5 = über 90%

7.2. Gaschromatographische Bestimmung

Die gaschromatographische Bestimmung der Probenextrakte nach 6.1 erfolgt für Organochlor- und Organophosphor- Pestizidrückstände und Pyrethroide mit ECD und NP-FID über zwei Kapillarsäulen unterschiedlicher Polarität.
Bei allen quantitativen Messungen ist darauf zu achten, daß die Signale für die jeweiligen Substanzen im linearen Arbeitsbereich des Detektors liegen.

8. Auswertung

8.1. Identifizierung und Kalibrierung

Einzelne Verbindungen in der Probe werden identifiziert, indem die Retentionszeiten der jeweiligen Peaks in den Proben-Gaschromatogrammen mit den unter den gleichen Bedingungen gemessenen Retentionzeiten der Substanzpeaks in Gaschromatogrammen einer Bezugslösung verglichen werden.
Enthält das Gaschromatogramm des Probenextraktes bei der substanzspezifischen Retentionszeit auf einer Kapillarsäule keinen Peak, so wird die Verbindung als nicht nachgewiesen betrachtet.
Die quantitative Auswertung erfolgt mittels Integrator über die Bestimmung und den Vergleich der Peakflächen der Analysenlösungen mit den Peakflächen von Standardlösungen. Die Ermittlung des Blindwertes ist über das Gesamtverfahren zu bestimmen.
Für jede gesuchte Verbindung des Bestimmungsverfahrens muß mit einem Einzelstandard oder einem Multikomponenten-Standard kalibriert werden.
Das gesamte Bestimmungsverfahren ist so gestalten, daß sich eine lineare Abhängigkeit zwischen Meßsignal und Konzentration ergibt.
Der lineare Arbeitsbereich wird durch mindestens 5 Punkte verschiedener Konzentrationen ermittelt.
Der lineare Arbeitsbereich liegt bei Organochlorpestiziden zwischen 0,01-2 mg/kg Wollwachs, bei Organophosphorpestiziden zwischen 0,01-5 mg/kg und bei Pyrethroiden zwischen 0,1-10 mg/kg.

R = Pestizidgehalt in mg/kg Wollwachs
A = Flächenwert der Probenlösung
B = Konzentration der Standardlösung in mg/l
C = Gelchromatographie-Volumenfaktor
D = Endvolumen der Probe in ml
E = Flächenwert der Standardlösung
F = Einwaage der Analysenprobe in g

Abb. 1: Gaschromatogramm einer Wollwachsprobe.

	7 = Lindan 8 = Dichlofenthion 11 = Interner Standard Ethion 12 = Interner Standard Mirex 13+14 = Cyhalothrin 15-18 = Cypermethrin 19 = Deltamethrin Kapillarsäule DB-1, Eluate 1+2 Meßbedingungen nach 5.2.2

Abb. 2: Gaschromatogramm einer Wollwachsprobe.

	6 = Propetamphos 8 = Diazinon 9 = cis-Chlorfenvinphos 12 = trans-Chlorfenvinphos Kapillarsäule DB-1, Eluate 3+4+5 Meßbedingungen nach 5.2.3

8.3. Bestimmung der Wiederfindungsraten

Die Bestimmung der Wiederfindungsraten erfolgte in Zusatzversuchen, bei denen Wollwachsproben mit definierten Mengen von Pestiziden versetzt wurden. Die ermittelten Wiederfindungsraten der Zusatzversuche sind in den Tab. 2 bis 5 zusammengestellt.

Parameter Spannweite Mittelwert S V min-max ----------------------------------------------------------------- Organochlorpestizide alpha-HCH 78-83 80,3 1,6 2,0 beta-HCH 78-85 80,3 2,4 3,0 lindan 80-85 81,5 2,1 2,6 delta-HCH 80-85 82,2 2,1 2,6 epsilon-HCH 79-85 81,5 2,3 2,8 Hexachlorbenzol 78-85 80,8 2,5 3,1 Aldrin 80-85 82,2 2,1 2,6 Dieldrin 85-90 89,3 3,4 3,8 Endrin 79-95 88,2 5,3 6,0 Heptachlor 80-88 83 2,8 3,4 cis-Heptachlorepoxid 78-90 83,8 4,3 5,1 trans-Heptachlorepoxid 79-88 85,2 3,5 4,1 cis-Chlordan 88-96 92,2 3,2 3,5 trans-Chlordan 80-90 84,7 3,3 3,9 alpha-Endosulfan 78-85 81,7 3,0 3,7 beta -Endosulfan 80-86 82,7 2,5 3,0 Endosulfansulfat 89-95 92,7 2,8 3,0 Methoxychlor 80-90 84,2 3,9 4,6 Mirex 85-100 90,5 6,1 6,8 2,4'-DDD 81-90 84,2 3,2 3,8 4,4'-DDD 79-83 80,7 1,5 1,9 2,4'-DDT 85-92 88,8 2,4 2,7 4,4'-DDT 80-89 83,3 3,6 4,3 2,4'-DDE 82-87 84,2 1,7 2,0 4,4'-DDE 80-98 91,7 6,4 7,0 Tetradifon 80-88 83,3 3,1 3,7 Pyrethroide Deltamethrin 90-99 92 4,1 4,5 cis-Permethrin 90-100 95 4,2 4,4 trans-Permethrin 88-99 92,5 5,7 6,1 Cypermethrin 89-95 91,5 2,3 2,5 Fenvalerat 88-93 90 1,7 1,9 Cyahalothrin 87-95 90,7 3,1 3,4 Cyfluthrin 87-91 89,3 1,5 1,7 ----------------------------------------------------------------- Tab. 2 : Wiederfindungraten der Zusatzversuche in Gew.% Anzahl der Versuche = 6. Wirkstoffzusatz bei Organochlorpestiziden = 0,1 mg/kg, bei Pyrethroiden = 1,0 mg/kg Wollwachs S = Standardabweichung in % V = Variationskoefizient in % Parameter Spannweite Mittelwert S V min-max ----------------------------------------------------------------- Organochlorpestizide alpha-HCH 77-85 81 2,8 3,5 beta-HCH 78-83 79,8 1,8 2,3 Lindan 79-86 81,3 2,5 3,1 Hexachlorbenzol 78-83 80,7 1,8 2,1 delta-HCH 80-85 81,5 2,1 2,5 epsilon-HCH 79-84 81,2 1,9 2,3 Aldrin 79-85 82,7 2,6 3,1 Dieldrin 85-100 96 2,6 2,7 Endrin 81-100 83,3 6,7 7,9 Heptachlor 82-96 89,8 4,9 5,5 cis-Heptachlorepoxid 80-98 91,3 6,3 6,8 trans-Heptachlorepoxid 87-100 94,7 4,4 4,6 cis-Chlordan 80-90 85 3,4 4,0 trans-Chlordan 80-93 86,2 4,7 5,5 alpha-Endosulfan 78-91 83 5,6 6,7 beta-Endosulfan 85-97 92,5 4,4 4,8 Endosulfansulfat 80-90 85 3,6 4,2 Methoxychlor 78-85 81,2 3,1 3,7 Mirex 89-100 93,5 4,0 4,3 2,4'-DDD 80-90 84,5 3,6 4,3 4,4'-DDD 80-85 83,8 3,9 4,7 2,4'-DDT 90-100 96,3 4,5 4,7 4,4'-DDT 80-95 85,3 5,2 6,1 2,4'-DDE 80-87 83,3 2,9 3,5 4,4'-DDE 79-93 82,8 5,4 6,5 Tetradifon 80-88 82,2 3,1 3,6 Pyrethroide Deltamethrin 95-103 98,7 2,9 2,9 cis-Permethrin 90-100 96,2 3,7 3,8 trans-Permethrin 96-100 98,5 1,5 1,5 Cypermethrin 87-100 93,7 5,9 6,3 Fenvalerat 95-105 98,3 3,8 3,9 Cyahalothrin 85-98 90,3 5,6 5,8 Cyfluthrin 92-100 98,7 2,8 2,9 ----------------------------------------------------------------- Tab. 3 : Wiederfindungraten der Zusatzversuche in Gew.% Anzahl der Versuche = 6. Wirkstoffzusatz bei Organochlorpestiziden = 0,5 mg/kg, bei Pyrethroiden = 2,5 mg/kg Wollwachs S = Standardabweichung in % V = Variationskoefizient in % Parameter Spannweite Mittelwert S V min-max ----------------------------------------------------------------- Organophosphorpestizide Diazinon 89-94 89,7 2,9 3,2 Dichlofenthion 80-85 83 2,4 2,9 Dimethoat 77-80 78,8 1,3 1,6 Malathion 88-96 91,3 3,3 3,6 cis-Chlorfenvinphos 79-95 87,8 5,4 6,2 trans-Chlorfenvinphos 80-90 86,2 3,7 4,3 Bromophos-ethyl 86-90 90 3,0 3,3 Bromophos-methyl 79-85 81,3 2,3 2,8 Tetrachlorvinphos 80-88 83,7 3,5 4,2 Fonofos 80-86 81,8 2,3 2,8 Fenitrothion 80-85 82,8 1,9 2,3 Fenchlorphos 79-84 81,7 2,0 2,5 Ethion 90-100 95,7 3,9 4,1 Parathion-ethyl 80-93 86,5 4,8 5,5 Parathion-methyl 80-90 84,7 3,3 3,9 Chlorpyriphos-ethyl 80-90 85,8 4,5 5,2 Chlorpyrifos-methyl 78-85 81,5 2,4 2,9 Carbophenothion 90-96 92,5 2,6 2,8 Propetamphos 82-88 84,7 2,2 2,6 Pirimiphos-ethyl 80-85 83,7 2,9 3,5 Pirimiphos-methyl 83-93 88,5 3,4 3,8 ----------------------------------------------------------------- Tab. 4 : Wiederfindungraten der Zusatzversuche in Gew.% Anzahl der Versuche = 6. Wirkstoffzusatz bei Organophosphorpestiziden = 0,1 mg/kg Wollwachs S = Standardabweichung in % V = Variationskoefizient in % Parameter Spannweite Mittelwert S V min-max ----------------------------------------------------------------- Organophosphorpestizide Diazinon 85-95 88,3 3,8 4,3 Dichlofenthion 80-85 82,5 2,3 2,8 Dimethoat 77-80 80,5 3,0 3,7 Malathion 85-95 88,3 2,3 2,6 cis-Chlorfenvinphos 90-100 96,3 3,8 3,9 trans-Chlorfenvinphos 80-84 82 1,7 2,1 Bromophos-ethyl 80-88 95,7 4,6 4,8 Bromophos-methyl 80-85 83,5 2,9 3,5 Tetrachlorvinphos 78-80 79 0,9 1,1 Fonofos 80-85 82,5 2,2 2,7 Fenitrothion 81-85 83,5 1,5 1,8 Fenchlorphos 82-90 86 3,4 4,0 Ethion 88-100 97,8 2,9 3,0 Parathion-ethyl 80-87 83,5 2,6 3,1 Parathion-methyl 79-85 81,2 1,9 2,3 Chlorpyriphos-ethyl 80-85 82,7 1,9 2,3 Chlorpyrifos-methyl 80-84 81,3 1,8 2,2 Carbophenothion 78-96 85,8 7,7 9,0 Propetamphos 85-100 94,5 5,6 5,9 Pirimiphos-ethyl 80-85 83 1,7 2,0 Pirimiphos-methyl 80-85 82 2,1 2,7 ----------------------------------------------------------------- Tab. 5 : Wiederfindungraten der Zusatzversuche in Gew.% Anzahl der Versuche = 6. Wirkstoffzusatz bei Organophosphorpestiziden = 0,5 mg/kg Wollwachs S = Standardabweichung in % V = Variationskoefizient in %

Zur Validierung wurden Zusatzversuche in verschiedenen Konzentrationen durchgeführt und die Wiederfindungsraten, Wiederholstandardabweichungen sowie Varianzkoeffizienten bestimmt. An den Wiederfindungsraten ist erkennbar, ob die Probenvorbereitung optimal durchgeführt wurde.
Eine hohe Widerfindungsrate ist Voraussetzung für eine gute Reproduzierbarkeit der Analysenergebnisse.
Die von uns ermittelten Wiederfindungsraten lagen für Organochlorpestizide bei Zusätzen von 0,1-0,5 mg/kg im Bereich 78-100 %, für Organophosphorpestizide bei Zusätzen von 0,1-0,5 mg/kg im Bereich 77-100 % und für Pyrethroide bei Zusätzen von 1,0-2,5 mg/kg im Bereich 85-105 %.

Bei der Beurteilung der Ergebnisse wurden für die Validierung zum Vergleich die Bedingungen der IUPAC (3) herangezogen.
Da die Anforderungen an die Wiederholstandardabweichungen und an die Wiederholbarkeit erfüllt worden sind, kann die vorliegende Arbeit als Standardmethode akzeptiert werden.

Nach unserer Erfahrung eignet sich die beschriebene Methode auch für die Bestimmung von Pestizidrückständen in Lanolin und in Wollwachsalkohol. Die Nachweisgrenzen für Pestizidrückstände im Wollwachsalkohol liegen um etwa Faktor zwei höher.
In von uns bereits in den Jahren 1985-1997 untersuchten Wollwachsmustern wurden hauptsächlich folgende Pestizidrückstände festgestellt: HCH-Isomere, DDT-Isomere und Metabolite, Dieldrin, Permethrin, Cypermethrin, Deltamethrin, Diazinon, Dichlofenthion, Bromophos-ethyl, Carbophenothion, Chlorfenvinphos und Propetamphos festgestellt.

8.4. Angabe der Ergebnisse

Die nach Abschnitt 8 erhaltenen Ergebnisse werden wie folgt angegeben:

im Bereich 0,01-0,10 mg/kg mit einer signifikanten Ziffer,
im Bereich 0,10-10 mg/kg mit zwei signifikanten Ziffern,

8.5. Prüfbericht

Der Prüfbericht ist so darzustellen, daß die Bedingungen der DIN EN 45001, Mai 1990 erfüllt werden.

9. Literatur

1. Rückstandsanalytik von Pflanzenschutzmitteln. DFG-Methoden- sammlung Methode S-19, 11. Lieferung, Verlag Chemie Weinheim, 1987 2. IUPAC, Pure and Applied Chem 62, 149-162, 1990